ABSTRACT Introduction. Research based on medicinal plants is one of the recommended strategies for the search for new therapeutic alternatives against leishmaniasis. In this study, the potential of products derived from Bixa orellana L. on Leishmania amazonensis, a causal agent of cutaneous leishmaniasis (CL), is demonstrated. Methods. Bixa seed products (extracts, fractions, sub-fractions and essential oil) were obtained, which were evaluated in different in vitro and in vivo biological models. Results. The hydroalcoholic extract caused inhibition of the growth of promastigotes and amastigotes, was able to control the development of experimental CL in BALB/c mice (100 mg/kg/day/15 days/intraperitoneal), and its chemical profile was obtained. Subsequently, a bioguided study was performed with 4 fractions and 28 sub-fractions, which BO-B1 and BO-B3 were promising and a group of aliphatic isomers (bixin and norbicin) were identified. The essential oil was the other product obtained, which was chemically characterized, inhibited the growth of amastigotes, showed a cytotoxicity seven times lower with respect to the activity on the parasite, was effective against the experimental CL (30 mg/kg/day/15 days/intraperitoneal and intralesional) and a specific inhibition of oxygen consumption and mitochondrial complex II was evidenced. The essential oil formulated in nanocochleates showed high efficacy in the murine model when 4 doses were administered intralesionally. The results of this research demonstrate the potential of B. orellana seeds on L. amazonensis for the treatment of CL, a disease with various clinical presentations that currently has limited therapeutic options.

RESUMEN Introducción . La investigación basada en plantas medicinales es una de las estrategias recomendadas para la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas contra la leishmaniasis. En este estudio, se demuestran las potencialidades de productos derivados de Bixa orellana L. sobre Leishmania amazonensis, agente causal de la leishmaniasis cutánea (LC). Métodos. Se obtuvieron los productos de las semillas de Bixa (extractos, fracciones, subfracciones y aceite esencial), los cuales fueron evaluados en diferentes modelos biológicos in vitro e in vivo. Resultados. El extracto hidroalcohólico causó inhibición del crecimiento de promastigotes y amastigotes, fue capaz de controlar el desarrollo de la LC experimental en ratones BALB/c (100 mg/kg/día/15 días/intraperitoneal), y se obtuvo su perfil químico. Posteriormente, se realizó un estudio bioguiado con 4 fracciones y 28 sub-fracciones, de las cuales BO-B1 y BO-B3 resultaron promisorias y se identificaron un grupo de isómeros alifáticos (bixina y la norbicina). El aceite esencial fue el otro producto obtenido, el cual fue caracterizado químicamente, inhibió el crecimiento de amastigotes, mostró una citotoxicidad 7 veces menor respecto a la actividad sobre el parásito, fue efectivo contra la LC experimental (30 mg/kg/día/15 días/intraperitoneal e intralesional) y se evidenció una inhibición de manera específica del consumo de oxígeno y el complejo II mitocondrial. El aceite esencial formulado en nanococleatos demostró una alta eficacia en el modelo murino al administrar 4 dosis por vía intralesional. Los resultados de esta investigación demuestran las potencialidades de las semillas de B. orellana sobre L. amazonensis para el tratamiento de la LC, enfermedad con diversas presentaciones clínicas que cuenta actualmente con limitadas opciones terapéuticas.

Introducción. La leishmaniasis es una enfermedad de gran prevalencia en Colombia, donde al menos seis especies diferentes la originan en el ser humano, con un amplio rango de características clínicas. La tipificación de la especie es importante, no solo desde el punto de vista epidemiológico, sino para el diagnóstico, dado que el tratamiento puede variar dependiendo de la especie identificada. En la identificación se han utilizado varias alternativas metodológicas con diferentes niveles de poder discriminatorio. Objetivo. Identificar especies de Leishmania mediante la amplificación molecular de un fragmento del gen hsp 70. Materiales y métodos. Se amplificó un fragmento del gen hsp 70 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR- hsp 70) y se hizo el análisis de los polimorfismos de la longitud ( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) de los fragmentos de restricción de 81 aislamientos clínicos de Leishmania spp. de pacientes con leishmaniasis cutánea y mucocutánea para la identificación de las especies presentes. Resultados. Se obtuvo un solo amplicón para todas las muestras analizadas. La restricción enzimática de los 81 productos permitió la identificación de 70 con dos patrones de bandas que correspondían a dos alelos de Leishmania braziliensis (62 y ocho aislamientos, respectivamente), nueve aislamientos compatibles con L. panamensis y dos con L. guyanensis . El origen geográfico de los aislamientos coincidió con el de reportes previos sobre la distribución de dichas especies en Colombia. Conclusiones. La técnica de la PCR- hsp 70 y el análisis de RFLP fueron útiles para identificar las especies de Leishmania aisladas de muestras clínicas de Colombia y pueden aplicarse también en el estudio de cepas de vectores y reservorios de importancia epidemiológica.

Introduction: Leishmaniasis is highly prevalent in Colombia, where at least six different species can cause disease of varying clinical presentations in humans. The identification of the infecting species is quite important for prognosis, therapeutics and epidemiology. Different techniques with variable discriminatory power have been used for the identification. Objective: To carry out the molecular identification of Leishmania species through the amplification of a fragment of the hsp 70 gene. Materials and methods: Molecular amplification of the hsp 70 gene fragment (PCR- hsp 70) followed by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) was done for identification purposes using DNA from 81 clinical isolates of Leishmania . Results: A single amplicon was obtained for all samples analyzed. The enzymatic restrictions of the 81 PCR products identified 70 with a banding pattern corresponding to L. braziliensis with two different patterns (62 and eight isolates, respectively), nine isolates compatible with L. panamensis and two with L. guyanensis . The geographical origin of the isolates is consistent with previous reports about the distribution of the corresponding species in Colombia. Conclusions: The PCR- hsp 70/RFLP technique used is a valid tool for the identification of Leishmania species isolated from clinical samples of patients in Colombia, which may also be applicable to the study of strains obtained from vectors and reservoirs with epidemiological significance.

The introduction of highly active antiretroviral therapy (HAART) has caused a marked reduction in the occurrence and severity of parasitic infections, including the toxoplasmic encephalitis (TE). These changes have been attributed to the restoration of cell-mediated immunity. This study was developed to examine the activity of six antiretroviral protease inhibitors (API) on Toxoplasma gondii tachyzoites. The six API showed anti-Toxoplasma activity, with IC50 value between 1.4 and 6.6 µg/mL. Further studies at the molecular level should be performed to clarify if the use of API could be beneficial or not for AIDS patients with TE.

La introducción de la terapia antirretroviral de alta efectividad ha causada una marcada reducción en la ocurrencia y curso clínico de las infecciones parasitarias, incluyendo la toxoplasmosis encefálica (TE). Estos cambios han sido atribuidos a la restauración celular. Este estudio fue desarrollado para examinar la actividad de seis inhibidores de proteasas antirretrovirales (IPA) sobre taquizoitos de Toxoplasma gondii. Los seis IPA mostraron actividad anti-Toxoplasma, con valores de CI50 entre 1.4 y 6.6 µg/mL. Futuros estudios a nivel molecular deben ser realizados, los cuales podrán delucidar si el uso de IPA pudiera beneficiar o no a los pacientes que sufren de TE.

Propolis is a resinous mixture of different plant exudates collected by honeybees. Currently, propolis is widely used as a food supplement and in folk medicine. We have evaluated 20 Cuban propolis extracts of different chemical types, brown (BCP), red and yellow (YCP), with respect to their in vitro antibacterial, antifungal and antiprotozoal properties. The extracts inhibited the growth of Staphylococcus aureus and Trichophyton rubrum at low µg/mL concentrations, whereas they were not active against Escherichia coli and Candida albicans. The major activity of the extracts was found against the protozoa Leishmania, Trypanosoma and Plasmodium, although cytotoxicity against MRC-5 cells was also observed. The BCP-3, YCP-39 and YCP-60 extracts showed the highest activity against P. falciparum, with 50% of microbial growth (IC50) values of 0.2 µg/mL. A positive correlation between the biological activity and the chemical composition was observed for YCP extracts. The most promising antimicrobial activity corresponds to YCP subtype B, which contains acetyl triterpenes as the main constituents. The present in vitro study highlights the potential of propolis against protozoa, but further research is needed to increase selectivity towards the parasite. The observed chemical composition-activity relationship of propolis can contribute to the identification of the active principles and standardisation of this bee product.

Introduction: leishmaniasis is a disease caused by several species from Leishmania genus, which has been increasingly reported in the last few years. Several genetic, immunological factors and others related to this parasite have been associated to the outcome of the infection, and the occurrence of illness in varied clinical forms. All the aforementioned has an impact on the diagnostic method that should be used. Methods: a basic and recent literature review was made, mainly focused on general aspects of leishmaniasis as epidemiological situation of disease, life cycle and transmission, vectors, clinical presentation and diagnosis; the latter shows information about the main methods used at present. The procedure followed by the Leishmania group at "Pedro Kourí" Institute of Tropical Medicine to support the diagnostic activities was presented as well. Results: updated practical information about the chosen topics was presented, with a practical guiding approach aimed at the health personnel that must face suspected leishmaniasis cases. Tables and figures summarized relevant aspects in an organized form, as well as the working algorithm of Institute concerning diagnosis was presented. The application of molecular diagnosis by this working team was particularly underlined. Conclusions: as leishmaniasis is still out of control, opportune diagnosis remains a must. All the methods provide useful information for taking decisions on clinical management, treatment and epidemiology of this parasitosis; hence, a working algorithm was submitted in our lab based on the most useful methods under our present conditions and experience.

Introducción: la leishmaniasis es una enfermedad causada por varias especies del género Leishmania, de la cual se han incrementado los reportes en los últimos años. Diversos factores genéticos, inmunológicos y asociados al parásito determinan el establecimiento de la infección y la ocurrencia de enfermedad, que se presenta en formas clínicas muy diversas, lo cual condiciona, entre otros elementos, el método diagnóstico que se aplica. Métodos: se hizo una revisión de la literatura básica y actualizada sobre aspectos generales de la leishmaniasis: la enfermedad y su situación epidemiológica, el ciclo de vida y la transmisión, vectores, presentaciones clínicas y diagnóstico; este último acápite contiene información sobre los principales métodos que se utilizan en el presente. Se puntualizó en la forma en que se apoya el diagnóstico desde el grupo de Leishmania del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", que constituye el centro nacional de referencia para esta enfermedad tropical. Resultados: se muestra información actualizada sobre los temas escogidos, con un enfoque orientador y práctico, dirigido al personal de salud que debe enfrentar casos con sospecha de leishmaniasis. Se muestran tablas y gráficos que resumen de manera organizada aspectos relevantes, así como el algoritmo de trabajo que se sigue en el instituto con relación al diagnóstico de esta enfermedad, con énfasis especial en las aplicaciones al diagnóstico molecular que ha realizado el grupo de trabajo. Conclusiones: debido a que la leishmaniasis permanece aún sin control, el diagnóstico oportuno continúa siendo una necesidad. Todos los métodos aportan información de utilidad para la toma de decisiones en el tratamiento clínico, la imposición del tratamiento y el enfoque epidemiológico de esta parasitosis. Entre ellos, proponemos un algoritmo de trabajo en nuestro laboratorio, con el empleo de los métodos que resultan más útiles de acuerdo a nuestras condiciones y experiencias.

Surfactant protein A (SP-A) is a hydrophilic pulmonary protein belonging to the collectin family, involved in lung homeostasis, the regulation of host defenses and inflammation. The present study addresses the activity of SP-A against promastigotes and amastigotes of Leishmania amazonensis and its cytotoxicity for host cells. SP-A exhibited similar activity against both parasite forms, with an IC50 of 34.0 ± 3.1 and 33.6 ± 1.1 µg/mL against promastigotes and amastigotes, respectively. It was moderately cytotoxic to peritoneal macrophages from BALB/c mice, exhibiting an IC50 value of 172.0 ± 6.1 µg/mL. This is the first report on the anti-leishmanial activity of SP-A.

La proteína surfactante A (SP-A), es una proteína pulmonar hidrofílica, de la familia de las colectinas, que contribuye al mantenimiento de la homeostasis en el pulmón y la regulación de los mecanismos de defensa e inflamación. En este estudio se reporta la actividad de la SP-A frente a Leishmania amazonensis en su forma promastigote y amastigote. La SP-A muestra actividad similar contra ambas formas del parásito, con un valor de CI50 de 34.0 ± 3.1 y 33.6 ± 1.1 µg/mL frente a promastigotes y amastigotes, respectivamente. La proteína causó una citotoxicidad moderada en macrófagos peritoneales procedentes de ratones BALB/c, con un valor de CI50 de 172.0 ± 6.1 µg/mL. Este es el primer reporte de la actividad anti-leishmanial de la SP-A.

Surfacen® is an exogenous natural lung surfactant, composed by phospholipids and hydrophobic proteins, which is applied successfully in Newborn Respiratory Distress Syndrome. In this paper, in vitro activity of Surfacen® against Leishmania amazonensis is described. The product showed activity against the amastigote form found in peritoneal macrophages from BALB/c mice, with an IC50 value of 17.9 ± 3.0 µg/mL; while no toxic effect on host cell was observed up to 200 µg/mL. This is the first report about the antileishmanial activity of Surfacen®.

Surfacen® es un surfactante natural exógeno extraído del pulmón, formado por fosfolípidos y proteínas hidrofóbicas, el cual es aplicado con éxito en el Síndrome de Distrés Respiratorio en Niños Recién Nacidos. En este trabajo, se describe la actividad in vitro del Surfacen® contra Leishmania amazonensis. El producto mostró actividad frente a amastigotes que se encuentran en macrófagos peritoneales de ratón BALB/c, con una CI50 de 17.9 ± 3.0 µg/mL, mientras no se observaron efectos tóxicos sobre la célula hospedera hasta 200 µg/mL. Este estudio constituye el primer reporte sobre la actividad antileishmania del Surfacen®.

Leishmaniasis is one of the most important parasitic infections, but current treatments are unsatisfactory due to their toxicity, cost and resistance. Therefore, the development of new antileishmanial compounds is imperative. Many people who live in endemic areas use plants as an alternative to treat the disease. In this paper, we characterised the essential oil from Piper auritum, evaluated its cytotoxicity and determined its antileishmanial activity. The chromatogram obtained by gas chromatography revealed 60 peaks and we found that safrole was the most abundant compound, composing 87% of the oil. The oil was active against the promastigotes of Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania braziliensis and Leishmania donovani with a favourable selectivity index against peritoneal macrophages from BALB/c mice. The Piper-oil inhibited the growing of intracellular amastigotes of L. donovani with an IC50 value of 22.3 ± 1.8 μg/mL. This study demonstrates the usefulness of the essential oils as a promising alternative to treat leishmaniasis.

Introducción. El análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado y el estudio del ADN polimórfico amplificado al azar han demostrado ser herramientas útiles para la tipificación de Leishmania. Objetivos. Estudiar la utilidad de las técnicas moleculares para la identificación y tipificación de cepas de referencia de Leishmania spp. del Nuevo Mundo y valorar su aplicabilidad a muestras clínicas. Materiales y métodos. Se aplicó PCR para amplificar el gen que codifica la cisteíno-proteinasa B, y el análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado utilizando ácido desoxirribonucleico de 16 cepas de referencia de Latinoamérica y de muestras clínicas de pacientes colombianos con leishmaniasis, y la técnica del ácido desoxirribonucleico polimórfico amplificado al azar utilizando ocho cepas de referencia. Se establecieron los patrones de bandas en cada caso. Resultados. Se obtuvo producto de amplificación en la PCR para Leishmania braziliensis, L. peruviana, L. panamensis y L. guyanensis. Para el resto, no fue posible amplificar el gen con los cebadores utilizados. La restricción mostró un patrón de bandas común para L. peruviana, L. guyanensis y L. panamensis, mientras L. braziliensis, presentaba un perfil individual único. El análisis de restricción del producto amplificado generó un patrón de bandas similar en los cinco pacientes estudiados, que se correspondía con el patrón generado por L. peruviana, L. guyanensis o L. panamensis. Mediante la amplificación al azar se obtuvieron patrones de bandas reproducibles con todas las cepas estudiadas, que posibilitaron la diferenciación. Se discuten las ventajas y limitaciones de ambos procederes. Conclusiones. El combinar ambas metodologías resultaría útil para identificar especies de importancia médica, tomando en cuenta sus ventajas y desventajas.

Introduction. The analysis of the PCR-restriction fragment length polymorphism and random amplified polymorphic DNA have been useful tools for Leishmania identification. Objectives. Molecular procedures were demonstrated for identification and typing of reference strains of New World Leishmania and their applicability was validated for clinical samples. Materials and methods. DNA was extracted from 16 reference strains of Latin American Leishmania as well as from clinical samples of leishmaniasis patients. A sequence coding for cysteine proteinase B was amplified by PCR and subjected to restriction fragment length polymorphism analysis. The enzyme used was Taq1. For eight of the reference strains, the random amplified polymorphic desoxyribonucleic acid technique (RAPD) was applied. Band patterns for Leishmania species differentiation were established each each method. The sample size of the clinical sample was of 5. Results. PCR products of the cysteine proteinase B gene were obtained for L. braziliensis, L. peruviana, L. panamensis and L. guyanensis. For the other species, L. mexicana, L. amazonensis, L. garnhami, L. lainsoni, L. chagasi, L. naiffi, no amplification occurred. The patterns of restriction fragments revealed band patterns in common for L. peruviana, L. guyanensis and L. panamensis, whereas L. braziliensis had a distinctive pattern. When human samples were examined, amplification occurred for all cases, and the profiles corresponded to the common profile of L. peruviana, L. guyanensis and L. panamensis. The RAPD technique demonstrated reproducible and distinctive patterns for each of the 8 reference strains, L. mexicana, L. amazonensis, L. garnhami, L. lainsoni, L. chagasi, L. naiffi, making possible to differentiate all them. The advantages and limitations of each procedure are discussed. Conclusions. The combination of RFP and RAPD methodologies provide useful tools to identify medical important species of Leishmania by recognizing DNA sequences characteristic of each species.

Até hoje não temos vacina contra a Leishmania e a quimioterapia é a indicação para o controle desta doença. Os remédios que hoje utilizamos são tóxicos e muito caros e além disso o resultado não é sempre o desejado. Por isso, uma terapia de combinação é a melhor opção. Este trabalho mostra que o óleo de essência de C. ambrosioides tem atividade sinérgica junto com a pentamidina sobre os promastigotas de L. amazonensis, diferente do resultado da combinação de antimônio de meglumine e anfotericina B e o óleo de essência.

To date, there are no vaccines against Leishmania, and chemotherapy remains the mainstay for the control of leishmaniasis. The drugs of choice used for leishmaniasis therapy are significantly toxic, expensive and with a growing frequency of refractory infections. Because of these limitations, a combination therapy is the better hope. This work demonstrates that the essential oil from Chenopodium ambrosioides shows a synergic activity after incubation in conjunction with pentamidine against promastigotes of Leishmania amazonensis. However, an indifferent effect has been found for combinations of meglumine antimoniate or amphotericin B and the essential oil.

The optimization of the PCR conditions for amplification of the gene coding for the 70kDa (HSp70) heat shock protein as well as the analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) were carried out. DNA from a reference strain of Leishmania mexicana was used as template. Analytical sensitivity and specificity, and reproducibility of PCR using DNA from L. mexicana, L.amazonensis, L. guyanensis and L. lainsoni were determined. A 1.3 kp band was obtained, which confirmed gene amplification. The band patterns derived from Haelll enzyme digestion allowed differentiating several species. L. guyanensis and L. lainsoni were different from each other, while L. mexicana and L. amazonensis, which shared a common pattern, were different from the other two species. Analytical sensitivity and specificity were adequate. The enzymatic restriction of the PCR product made it possible to differentiate Leishmania spp. from T. cruzi. The feasibility of identifying and typifying species from the American continent through PCR-RFLP/Hsp70 and of using enzymatic restriction of amplified product to distinguish Leishmania spp. from Trypanosoma cruzi was shown. This was the first step in implementing these molecular methods in the reference laboratory of the Institute.

Se realizó la estandarización de las condiciones de amplificación del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de Leishmania mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Hsp70), así como el análisis posterior de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del producto amplificado, utilizando como molde ADN puro de una cepa de referencia de Leishmania mexicana. Se estudió la sensibilidad y especificidad analíticas de la PCR, así como la reproducibilidad, utilizando ADN de L. mexicana, L. amazonensis, L. guyanensis y L. lainsoni. Se obtuvo una banda de 1,3 Kpb, demostrándose la amplificación del gen que codifica para la Hsp70. Los patrones de bandas obtenidos tras la digestión enzimática, utilizando la enzima Hae III, permitieron establecer diferencias entre las especies estudiadas: L. guyanensis y L. lainsoni se diferencian entre sí y estas a su vez de L. mexicana y L. amazonensis, que mostraron un patrón de bandas común. La sensibilidad y especificidad analíticas de la técnica fueron adecuadas. Se demostró la factibilidad de identificar y tipificar especies del continente americano mediante la PCR-RFLP/Hsp70, y de utilizar la restricción enzimática del producto amplificado para distinguir entre Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi, dándose un primer paso en el establecimiento de estos métodos moleculares en el laboratorio de referencia del instituto.